KOLINOTOKSIN AF64A: MODEL DEFISIENSI KOLINERGIK DI OTAK
Pendahuluan
Sejumlah laboratorium telah mengembangan metode terhadap hewan model dengan tingkat defisiensi kolinergik yang persisten. Hal ini bukan merupakan hal yang mudah karena secara normal sistem kolinergik akan cepat mengalami perbaikan dari induksi gangguan non-degenerasi. Beberapa metode dikembangkan untuk menghasilkan lesi degenerasi pada syaraf kolinergik secara in vivo. AF64A merupakan salah satu kolinotolsin yang didesain bersifat seleksif dan memiliki efek dengan durasi yang lama dalam menimbulkan lesi di sistem kolinergik. Hal ini dikarenakan sturktur kimia dari AF64A yang mirip dengan kolin dan adanya bagian molekul aziridinium yang bersifat sitotoksin (Hanin, 1996).
Efek pemberian AF64A yang secara selektif menyebabkan lesi pada syaraf kolinergik dapat membantu mempelajari tentang peranan penting syaraf kolinergik secara spesifik. Selain itu juga dapat digunakan dalam penelitian yang terkait dengan defisiensi kolinergik seperti plastisitas neuronal dalam learning dan memori serta penyembuhan dari luka maupun mekanisme dan terapi pada penyakit Alzheimer.
Agar dapat mempelajari hal tersebut memerlukan hewan coba yang peka untuk diinduksi dengan AF64A agar bisa memberi gambaran yang mirip dengan yang sebenarnya, baik dari segi gejala yang timbul maupun perubahan morfologi yang akan terjadi. Oleh karena itu, penting untuk mengetahui pemilih hewan model yang tepat dan bagaimana caranya membuat model defisiensi kolinergik yang benar menggunakan kolinotoksinAF64A agar memberikan hasil penelitian tentang defisiensi kolinergik yang baik dan benar.
Acetylethylcholine Mustard Hydrochloride (AF64A)
Acetylethylcholine mustard hydrochloride (AF64A) merupakan suatu kimia yang bersifat neurotoksin dan memiliki dampak yang spesifik terhadap terminal syaraf kolinergik (Ishii et al., 1990). Penggunaan AF64A sering lakukan untuk mendapatkan model degenerasi pada syaraf kolinergik yang dapat menjadi model untuk penyakit Alzheimer (Fisher dan Hanin, 1986; Dudas et al., 2003; Tong-Un et al., 2010), penelitian yang berhubungan dengan proses learning dan memori (Yamazaki et al., 1991), serta apoptosis (Harms et al., 2000).
Secara struktural AF64A memiliki memiliki struktur yang mirip dengan kolin kecuali 2 grup metilnya pada bagian aziridinium dan metil ke-3 yang mengalami perpanjangan menjadi grup ethyl (gambar 1) (Santiago et al., 1998). Bagian struktur aziridinium dari AF64A memiliki peranan yang penting dalam kolinotoksisitas baik secara in vitro maupun in vivo. Destruksi dari cincin azirinidium dengan pH tinggi atau dengan thiosulfate dapat menyebabkan aktivitas biologinya menghilang (Hörtnagl et al., 1988).
AF64A secara selektif dapat diambil melalui sistem high-affinity choline transporter karena kemiripin strukturnya dengan kolin dan dapat masuk ke syaraf kolinergik (Fan dan Hanin, 1999). Masuknya AF64A melalui sistem high-affinity choline transporter menyebabkan akumulasi neurotoksin di terminal syaraf kolinergik dan dapat menghambat sistem transporter itu sendiri. Terbentuknya ikatan kovalen pada transporter menyebabkan jumlah kolin yang diambil untuk masuk kembali ke syaraf kolinergik menjadi sedikit atau terbatas (Rylett dan Walter, 1990).
Setelah AF64A masuk ke terminal syaraf kolinergik, neurotoksin ini akan ditransport secara retrograde melewati akson menuju badan sel dan inti (Fan dan Hanin, 1999). AF64A yang mencapai inti dapat berinteraksi dengan molekul DNA dan menyebabkan alkilasi N-7 guanine sertadapat menimbulkan lesi pada terminal transkripsi RNA. Secara struktur kimia, AF64A memiliki kemiripan dengan agen sitotoksin yaitu agen alkilasi nitrogen mustrad (gambar 1) (Futschet et al., 1992). Menurut Fan dan Hanin (1999), lesi pada terminal transkripsi RNA dapat menurunkan mRNA ChAT serta menurunkan produksi enzim kolin asetiltransferase. Selain itu secara in vitro pada sel neuroblastoma AF64A dapat menurunkan ekspresi mRNA N-myc sehingga terjadi penurunan sintesis protein N-myc yang berperan penting dalam diferensiasi dan proliferasi sel (Santiago et al., 1998). Hal ini menunjukkan peranan AF64A sebagai agen alkilasi.
Gambar 1. Struktur kimia kolin, AF64A dan nitrogen mustard (Santiago et al., 1998).
Menurut Kasa dan Hanin (1985) AF64A ini dapat menghambat transport materi intra-aksonal seperti memblokir transport enzim asetiltransferase di tubulin pada membran retikulum endoplasma halus serta struktur aksonal lainnya yang berperan dalam mekanisme transport materi. Adanya gangguan pengangkutan enzim dapat menyebabkan penuruanan aktivitas dari enzim itu sendiri. Setelah pemberian AF64A juga terlihat penurunan aktivitas asetiltransferase (Millar et al., 1987).
Keterbatasan kolin yang diambil kembali akibat gangguan pada aktivitas high-affinity choline transporter, penurunan enzim kolin transferase dan asetiltransferase, terganggunya transport aksonal menyebabkan terjadinya gangguan sintesis dan pembebasan asetilkolin sehingga menyebabkan penurunan atau disfungsi syaraf kolinergik maupun degenerasi syaraf kolinergik akibat pemberian AF64A (Santiago et al., 1998; Ishii et al., 1990).
Kolinotoksisitas AF64A
Efek AF64A bersifat selektif pada syaraf kolinergik tergantung pada dosis dan cara pemberian. AF64A memiliki afinitas yang kuat terhadap sistem high-affinity choline transporter sehingga dapat dapat menghambat sistem high-affinity choline transporter itu sendiri. Oleh karena itu pengaturan dosis AF64A yang tepat penting guna menghindari gangguan uptake AF64A akibat efek dari AF64A itu sendiri. AF64A dengan konsentrasi rendah (2,3-4.5 uM) akan memberi efek yang reversibel, sedangkan konsentrasi yang tinggi (>22,5 uM) akan memberi efek yang ireversibel. Hal ini menunjukkan ini dosis pemberian mempengaruhi kolinotoksisitas AF64A. (Curti dan Marchbanks, 1984; Pittel et al., 1987).
Cara pemberian yang berbeda memberikan gambaran selektifitas area defisensi kolinergik yang juga berbeda. Pada awalnya diduga AF64A tidak dapat menembus blood brain barrier (BBB), hal ini menyebabkan pemberian AF64A dilakukan langsung ke sistem syaraf pusat melalui injeksi intra cerebral ventrikuler. Namun efek dari cholinotoxin ini tergantung pada sisi dari administrasi obat (Hanin, 1996). Menurut Pittel et al. (1989) hipofungsi kolinergik pada unilateral korteks serebri dapat dihasilkan dari pemberian AF64A secara intracarotid dengan membuka BBB dengan pemberian gliserol hipertonik. Ishii et al. (1990) melakukan pemberian AF64A secara intra peritoneal pada tikus dan dapat menyebabkan kerusakan diberbagai regio otak.
Tabel 1. Pengaruh pemberian AF64A pada tikus wistar secara intraperitoneal terhadap level asetilkolin di beberapa regio otak yaitu korteks, hipokampus, dan striatum (Ishii et al., 1990).
Pemberian Af64A melalui intraperitoneal baik sekali injeksi (dosis 23,7 μmol/kg) maupun pemberian berulang (dosis inisiasi 21 μml/kg dan 3,1 μmol/kg selama 9 hari) menyebabkan penurunan level asetilkolin sebanyak 10% dari kontrol (tanpa AF64A). Regio otak yang paling terpengaruh adalah hipokampus. Pemberian AF64A baik sekali injeksi maupun berulang menunjukkan penurunan level asetilkolin meskipun telah mencapai hari ke-20 dari injeksi AF64A terakhir. Selain itu, pemberian AF64A secara berulang menyebabkan 10% penurunan berat badan pada hari ke 4 setelah injeksi pertama serta menunjukkan gejala piloereksi, lethargy, atoxia, dan epistaxis sekitar 5 hari setelah injeksi pertama (Ishii et al., 1990).
Hewan Coba dalam Aplikasi AF64A
Dalam membuat model defisiensi kolinergik menggunakan AF64A, hewan coba yang sering digunakan yaitu tikus. Menurut Hanin (1990) mencit bersifat lebih toleran terhadap efek AF64A dibandingkan tikus. Pemberian 5nmol AF64A pada ventikel ke tiga pada mencit tidak menunjukkan kerusakan jaringan, sedangkan pada tikus dengan dosis optimal (tidak lebih dari 2.0 nmol) menunjukkan secara selektif terjadi defisiensi kolinergik. Strain tikus yang sering digunakan untuk aplikasi AF64A yaitu tikus wistar jantan dengan berat berkisar 180-200 gram (Ishii et al., 1990; Maneesub et al., 1993; Uabundit et al., 2010; Tong-Un et al., 2010) dan sprague dawley jantan dengan berat berkisar 250-390 gram (Kása dan hanin, 1985; Hörtnagl et al., 1988; Hörtnagl et al., 1991; Hörtnagl et al., 1993, Wörtwein et al., 1994; Fan dan Hanin, 1994).
Daftar pustaka
Curti, D., dan Marchbanks, R.M., 1984. Kinetics of irreversible inhibition of choline transport in synaptosomes by ethylcholine mustard azidinium. J. Membrane Biol., 82:529-568.
Dudas, B., Rose, M., dan Hanin, I., 2003. Dose-dependent effect of cholinotoxin AF64A on the cholinergic elements of the cingulum bundle in rat. Brain Research. 965:295-298.
Fan, Q.I., dan Hanin, I., 1999. Effects of AF64A on Gene Expression of Choline Acetyltransferase (ChAT)in the Septo-Hippocampal
Fisher, A., dan Hanin, I., 1986. Potential animal models for senile dementia of Alzheimer’s type, with emphasis on AF64A-induced cholinotoxicity. Rev. Pharmac. Toxicol. 26:161-181.
Futscher, B.W., Pieper, R.O., Hanin, I., dan Erickson, L.C., 1992. DNA-Damaging and Transcription-Terminating Lesions Induced by AF64A In Vitro. J. Neurochem. 58: 1504-1509.
Hanin, I., 1996. The AF64A model of cholinergic hypofunction: An Update. Life Sci., 58:1955-1964.
Harms, C., Lautenschlager, M., Bergk, A., Freyer, D., Weih, M., Dimagl, U., Weber, J., dan Rtnagl, H.H., 2000. Melatonin is protective in necrotic but not in caspasedependent, free radical-independent apoptotic neuronal cell death in primary neuronal cultures. The Fabeb Journal. 14: 1814-1824.
Hörtnagl, H., Potter, P.E., Happe, K., Goldstein, S., Leventer, S., Wülfert, E., dan Hanin, I., 1988. Role of Aziridinium Moiety in The In Vivo Cholinotoxicity of Ethylcholine Aziridinium Ion (AF64A). J. Neurosci. Methods. 23:107-113.
Hörtnagl, H., Berger, M.L., Reither, H., dan Hornykiewicz, O., 1991. Cholinergic deficit induced by ethylcholine aziridium (AF64A) in rat hippocampus: Effect on glutamatergic systems. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol. 344:213-219.
Hörtnagl, H., Berger, M.L., Havelec, L., dan Hornykiewicz, O., 1993. Role of glucorticoids in the cholinergic degeneration in rat hippocampus induced by ethylcholine aziridinium (AF64A). The journal of neuroscience. 13(7):2939-2945.
Ishii, T., Miwa, T., Nishio, H., dan Yagasaki, O., 1990. The Biochemical and Ultrastructural Examinations in Central Cholinergic Damage of the Rat Induced by the Intraperitoneal Administration of AF64A, Japan. J. Pharmacol. 54:415-423.
Kása, P., dan Hanin, I., 1985.Ethylcholine Mustard Aziridinium Blocks the Axoplasmic Transport of Acetylcholinesterase in Cholinergic Nerve Fibres of the Rat. Histochemistry. 83: 343-345.
Maneesub, Y., Sanvarinda, Y., dan Govitrapong, P., 1993. Partial restoration of choline acetyltransferase activities in aging and AF64A-lesioned rat brains by vitamin E. Neurochem. Int. 22(5): 487-491.
Millar, T.J., Ishimoto, I., Boelen, M., Epstein, M.L., Johnson, C.D., dan Morgan, G., 1987. The Toxic Effects of Ethylcholine Mustard Aziridinium Ion on Cholinergic Cells in the Chicken Retina. The Journal of Neuroscience. 7(2): 343-356.
Pittel, Z., Fisher, A., dan Heldman, E., 1987. Reversible and Irreversible Inhibition of High Affinity Choline Transport Caused by Ethycholine Aziridinium Ion. J. Neurochem. 49: 468-474.
Rylett, R.J., dan Walters, S.A., 1990. Uptake and Metabolism of [3H]choline mustard by cholinergic nerve terminals from rat brain. Neuroscience. 36: 483-489.
Santigo, L.R., Erickson, L.C., dan Hanin, I., 1998. AF64A-Induced Changed in N-myc Expression in the LA-N-2 Human Neuroblastoma Cell Line are Modulated by Choline and Hemicholinium-3. Neurochemical Research. 23(5): 743-750.
Tong-Un, T., Muchimapura, S., Phachonpai, W., dan Wattanathorn, J., 2010. Nasal Administration of Quaercetin Liposomes Modulate Cognitive Impairment and Inhibit Acetylcholinesterase Activity in Hippocampus. American Journal of Neuroscience. 1(1):21-27.
Uabundit, N., Wattanathorn, J., Mucimapura, S., dan Ingkanina, K., 2010. Cognitive enhancement and neuproprotective effect of Bacopa monnieri in Alzheimer’s disease model.
Wörtwein, G., Stackman, R.W., dan Walsh, T.J., 1994. Vitamin E prevents the palce learning deficit and the cholinergic hupofunction induced by AF64A. Experimental neurology. 125:15-21.
Yamazaki, N., Kato, K., Kurihara, E., dan Nagaoka, A., 1991. Cholinergic drugs reverse AF64A-induced impairment of passive avoidance learning in rats. Psychopharmacology. 103:215-222.
