PENGHAMBATAN REPLIKASI VIRUS RABIES DENGAN RNAi

Pendahuluan

Penghambatan replikasi virus rabies dengan RNAi merupakan suatu strategi terapi yang sangat potensial terutama akibat kegagalan tindakan vaksinasi rabies post ekposure. Namun dengan otak sebagai targetnya, faktor seperti blood barrier brain (BBB) harus diperhatikan. Aplikasi dsRNA tidak dapat melewati BBB, sehingga dikembangkan metode baru dengan artificial miRNA (amiRNA) yang ukurannya lebih kecil (Israsena et al., 2009).

Gambar 1. Gambaran ideal aplikasi RNAi dengan organ target otak. Melalui miRNA diharapkan dapat menghambat sintesis suatu protein dari mRNA (Boudreaua dan Davidson, 2010).

Penghambatan Replikasi melalui artificial miRNA secara in vitro

Protein N merupakan protein yang penting dalam melindungi genome virus saat replikasi agar tidak didegradasi oleh RNase. Dengan menghambat sintesis protein N diharapkan replikasi dapat terhambat. Oleh karena itu, mRNA protein N dapat meruapakan target yang potensial dapat aplikasi artificial miRNA.

           

Berikut adalah metode penelitian tentang penghambatan replikasi virus rabies melalui artificial miRNA secara invitro oleh Israsena et al. (2009). Dengan metode ini masih terus dapat dikembangkan misalnya dengan pemilihan vektor yang tepat yang sesuai bagi hospes dan mampu menembus BBB melalui penelitian secara in vivo.

Materi dan metode  (oleh Israsena et al., 2009)

1. Sel dan virus

Sel yang digunakan untuk kultur yaitu sel Neuro2A (ATCC cat no. CCL-131), dengan media HyQ MEM/EBSS (Hyclone) yang ditambahkan 10% fetal bovine serum, 2mM L-glutamine, 1,5 g/l NaHCO₃, 1 Mm Sodium Pyruvate, 1 x Non-Essential Amino acid (NEAA), 100 U penicillin/ ml, dan 100 μg strptomycin/ml , yang diinkubasi pada suhu 37°C, 5% CO₂.   

           

Virus rabies yang digunakan adalah RV challenge virus strandard (CVS)-11, HEP flurry GFP fixed strain, dan street virus. Tissue Culture Infeksi Dose 50 (TICID50) yaitu 10⁵, dalam penelitian digunakan 10 atau 100 TCID50.

2. Plasmid

Sequence gene target virus rabies dapat didesain menggunakan miRNA design algorithm (http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/).

Gambar 2. desain miRNA virus rabies. Lokasi artificial miRNA yang akan berasosiasi dengan mRNA virus yang akan dikode (Israsena et al., 2009).

Komplementari ssDNA oligo yang mengkode pre-miRNA disintesis, anneling, dan diklon menjadi pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR (Invitrogen). Pol II miR RNAi diekpresikan oleh vektor yang mengandung spesifik miR-155 flanking sequence. Agar menghasilkan rantai miRNA dalam satu transkripsi awal, miRNA cassettes dari plasmid donor dieksisi dengan enzim restriksi, BamH1 dan Xho1

Gambar 3. Skema tentang strategi kloning untuk kombinasi miRNA cassettes menjadi satu pre-miRNA transkripsi (Israsena et al., 2009).

3. Transfeksi miRNA dengan plasmid ekpresi

Sebelum ditranfeksi, kultur Neuro2A ditumbuhkan selama 24 jam. Kemudian baru ditranfer miRNA plasmid. Plasmid DNAs dicampurkan dengan lipofectamine 2000 (Invitrogen) dengan rasio 1:1 (1μl lipofectamine 2000 per 1μg DNA) dalam opti-MEM medium (Invitrogen). Campuran ini dirambahkan ke dalam kultur Neuro2A (plated 1 x 10⁵ sel per sumuran dalam 24 sumuran plate).  

4. Viral challenges assay

12 jam setelah transfeksi, 10 atau 100 TCID50 dari stok virus ditambahkan ke sel pada tiap sumuran. Perubahan pada media terlihat 6 jam inkubasi pada 37°C. RNA diisolasi 24, 48, dan 72 jam setelah ditantang dengan virus.

5. Isolasi RNA

Total RNA diisolasi dari sel setelah 24, 48, dan 72 jam setelah infeksi dengan menggunakan RNeasy mini kit (Qiagen). Supernatan kultur di panen setelah 48 jam, dan RNA dari cairan supernatan dipurifikasi menggunakan QIAamp viral RNA mini kit (Qiagen) berdasarkan petunjuk manufaktur.

6. Kuantifikasi genome virus dan trankrip

a. RT

Reverse transkripsi dilakukan menggunakan M-MLV reverse transcriptase (Promega) dengan 4μl dari toral RNA yang diisolasi dari sel/ supernatan yang diinfeksi (20ng/μl). Oligo dT digunakan sebagai primer RT untuk deteksi mRNA. Primer RT yang digunakan untuk deteksi genome viral yaitu 5’-AGAAGGATCGTGGAGCACCATACTCTCA-3'

b. Real-time PCR

4μl cDNA ditambahkan ke dalam 10μl QuantiTect SYBR green PCR master mix (Qiagen), 0.5 μl dari 20μM forward primer, 0.5μl dari 20 μM reverse primer, 5μl RNase-free water. Profil thermal cycling yang digunakan yaitu 95°C 1 menit, diikuti 40 siklus amplisikasi (95°C 15 menit, 55°C 20 detik, dan 72°C selama 30 detik). Untuk CVS gene N digunakan forward primer 5’CTGGCAGACGACGGAACC-3’ dan reverse primer 5’-CATGATTCGAGTATAGACAGCC-3’.   Untuk HEP-flurry gene N digunakan forward primer 5’-CTGGCAGATGACGGAACT -3’ dan dan reverse primer 5’-CATGATTCGAGTATAGAC-AGCT-3’. Untuk deteksi genome viral digunakan forward primer 5’-AGAAGGATCGTGGAGCACCATACTCTCA-3’ dan reverse primer 5’-TACCAGCCCTGAACAGTCTTCA-3’.

7. Kuantifikasi mature miRNA

a. Stem-loop RT-PCR

5μl sampel RNA (2ng/μl) dicampurkan dengan 7μl RT master mix dari Taq man Micro RNA Reverse Transcription kit (ABI) (1.5μl 10 x RT buffer, 0.15 μl 100 mM dNTPs, 0.19μl dari 20U/μl RNase Inhibitor, 1.0 μl dari 50U/μl Multiscribe RT enzyme, 4.16 μl RNase-free water), 3μl spesifik loop-RT primer (N1: CGACTCATGCTGACGAATTTTGAGTCGCAAA) ditambahkan ke campuran. Reaksi RT dibiarkan pada suhu 16°C 30 menit kemudian 42°C 30 menit sebelum inkubasi terminal pada suhu 85°C selama 15 menit.

           

5μl cDNA dari reaksi PCR dicampurkan dengan 4.0μl LightCycler Taqman master mix (Roche), 0.4μl dari 10μM forward primer, 0.4 μl dari 10μM reverse primer, o0.2μl dari 10μM Pprobe, 10μl RNase-free water. Sequence dari PCR primer dan probe adalah NP1 forward primer: CCGCCCTACATCATCCG, NP2 forward primer: CCCCTAAAGATGCATGTTCAG, reverse primer: GCGACTCATGCTGACGAA, NP1 probe 6FAM-TTTGAG+TCGCAAAC+T+TGATCC-BBQ, NP2 probe: 6FAM-TTTGAG+TCGCG+TC+TCTG-BBQ. Thermal cycling PCR yaitu 95°C 5 detik, 55°C 5 detik, dan 60°C 5 detik.

8. Immunoflourescence

Untuk melihat keberadaan protein N virus rabies dapat dilakukan dengan pewarnaan imunoflourescence menggunakan antibodi terhadap protein N virus rabies yang telah dilabel dengan FITC (hijau). 48 jam setelah diinfeksi, sel difiksasi dengan 80% acetone dan diwarnai dengan FITC-labeled virus rabies N protein-spesifik antibodi.

Berdasarkan hasil penelitian Israsena et al. (2009)  terlihat penurunan jumlah genome virus dan mRNA protein N virus rabies secara spesifik pada sel kultur yang ditranfeksi dengan miRNA (dengan vektor plasmid) dan ditantang dengan virus rabies. 

Diagram 1. (A) level mRNA dari protein N virus rabies. Terlihat penurunan level mRNA  protein N pada sel yang ditransfeksi artificial miRNA (amirRNA) dibanding kontrol (postitif rabies, tanpa amiRNA). (B) level genome virus. Terlihat Terlihat penurunan level genome virus rabies pada sel yang ditransfeksi artificial miRNA dibanding kontrol (postitif rabies, tanpa amiRNA) (Israsena et al., 2009).

Gambar 4. Hasil imunofluoresecence dengan antibodi terhadap protein N virus rabies. (A) kontrol positif (postitif rabies, tanpa amiRNA), terlihat ekpresi protein dengan intensitas yang tinggi. (B) sel yang ditransfeksi artificial miRNA (amirRNA), bila dibanding kontrol, ekpresi protein N lemah atau tidak ada. Hal ini menunjukkan ekpresi protein N pada rabies dapat dihambat oleh amiRNA. (Israsena et al., 2009).

Kesimpulan

Replikasi virus rabies dapat dihambat melalui pengembangan RNA interference melalui artificial microRNA (amiRNA) terhadap protein N virus rabies secara in vitro.

Daftar pustaka

Boudreaua, R.L., dan Davidson, B.L., 2010. Rnai Therapeutics For CNS Disorders .  Brain research. 1338:112-121

Israsena, M., Supavomwong, P., Ratanasetyuth, N., Khawplod, P., dan Hemachuda, T., 2009. Inbihition of rabies virus replication by multiple artificial microRNAs. Antiviral Research. 84:76-83.