IMUNOHISTOKIMIA (IHC) 5’-BROMO-2’DEOXYURIDINE (BrdU) DALAM STUDI PROLIFERASI SEL

5’-bromo-2’deoxyuridine (BrdU) merupakan analog thymidin yang dapat terintegrasi dengan DNA pada sel yang membelah selama fase sintesis (S) pada siklus sel sehingga adanya sel yang imunoreaktif terhadap BrdU dapat dijadikan indikator proliferasi sel (Taupin, 2007).

Gambar 1. Gambaran rantai kimia thymidine dan BrdU.

Gambar 2. Gambaran siklus sel dan BrdU dalam fase sintesis (S)

Aplikasi BrdU

Pada tikus dapat diinjeksi BrdU (B5002, Sigma-aldrich) dengan dosis 200 mg/kg BB secara intraperitoneal atau i.p (Pham et al., 2003). Sediaan BrdU disiapkan dengan konsentrasi 20 mg/ml dalam NaCl fisiologis 0.9%  hangat pada saat akan digunakan (Epp dan Galea, 2009). Dua jam setelah injeksi BrdU, hewan dapat dieuthanasia untuk dikoleksi sampel organ. Malberg et al (2000) menyatakan bahwa otak yang dikoleksi dari tikus yang telah diinjeksi BrdU 2 jam sebelum euthanasia menunjukkan adanya sel-sel yag imunoreakstif terhadap BrdU. Namun interval waktu lamanya hewan dieuthanasia untuk koleksi sampel organ dari saat BrdU diinjeksi tergantung pada kepentingan penelitian itu sendiri.

Gambar 3. Gambaran aplikasi BrdU secara intraperitoneal (i.p) pada tikus (Irawan, 2012).

Imunohistoimia BrdU

Sampel organ yang dikoleksi (misalnya thymus dan otak) selanjutnya dilakukan fiksasi, pembuatan blok paraffin serta pemotongan jaringan dan pelekatan irisan jaringan pada slide. Slide jaringan tersebut selanjutnya akan digunakan untuk proses pewarnaan BrdU secara imunohistokimia. Sebagai kontrol positif untuk teknik IHC terhadap BrdU digunakan organ thymus. Hal ini dikarenakan thymus merupakan organ yang aktif membelah.

Metode IHC BrdU (Irawan, 2012)

Setelah slide jaringan mengalami proses deparafinisasi dan rehidrasi sesuai prosedur histologi, jaringan direndam dalam aquadest selama 1 menit. Slide yang telah direhidrasi kemudian dimasukkan ke dalam larutan antigen retrieval yaitu Tris buffer (10mM Tris base, 0,1% tween 20, pH 10) yang sebelumnya dipanaskan dalam microwave selama 4 menit dengan suhu larutan 90 ºC dan di inkubasi selama 60 menit dalam inkubator 60 ºC. Slide kemudian dicuci dalam Tris buffered saline (TBS) selama 1 menit (0.05 M Tris base, 0,9% NaCl, pH 8.4) sebanyak tiga kali pada suhu ruang masing-masing selama 5 menit. Permeabilitas jaringan selanjutnya ditingkatkan dengan cara diinkubasi dengan GIBCO Trypsin-EDTA (0.25% Trypsin-EDTA 4Na, Invitrogen) dalam  inkubator suhu 37 ºC selama 30 menit. Slide dicuci kembali dengan aquadest selama 10 menit sebanyak dua kali.

Slide kemudian ditetesi dengan HCl 2N selama 30 menit pada suhu 66 ºC guna mendenaturasi DNA. Slide dicuci dengan TBS sebanyak tiga kali masing-masing 5 menit selanjutnya peroksidase endogenous diblok dengan H₂O₂ 3% dalam TBS selama 30 menit pada suhu ruang. Slide kemudian dicuci kembali dengan TBS sebanyak tiga kali masing-masing 5 menit.

Latar belakang (background) jaringan diblok dengan Sniper selama 15 menit pada suhu ruang dan kemudian jaringan ditetesi dengan antibodi primer yaitu anti BrdU mouse monoclonal IgG (1:100, NCL-BrdU, Novocastra, Leica microsystems), sedangkan kontrol negatif tidak diberi antibodi primer, hanya ditetesi pelarut antibodi (diluent buffer). Slide jaringan tersebut diletakkan secara horizontal pada kotak lembab dan ditutup rapat selama satu malam pada suhu 4°C.

Pada hari berikutnya, sediaan dicuci  menggunakan TBS sebanyak tiga kali masing-masing selama 5 menit dan ditetesi Trekkie Universal Link (antibodi sekunder- biotinylated) selama 20 menit pada suhu ruang. Slide jaringan dicuci dengan TBS sebanyak tiga kali masing-masing selama 5 menit dan kemudian ditetesi dengan Trek Avidin HRP selama 10 menit pada suhu ruang. Slide dicucidengan TBS sebanyak tiga kali masing-masing 5 menit dan pada pencucian ketiga larutan Betazoid diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) sebagai kromogen disiapkan dengan perbandingan DAB dan larutan buffer 1:50.

Jaringan ditetesi dengan DAB selama 2 menit kemudian dicuci dalam aquadest sebanyak tiga kali masing-masing selama 1 menit dan diwarnai dengan larutan hematoxylin Harris selama 15 detik sebagai counterstain.  Slide kemudian dialiri dengan air mengalir selama 2 menit dan didehidrasi dalam etanol bertingkat, clearing dalam xylol, dan ditutup dengan kaca penutup yang sebelumnya telah ditetesi dengan xylol dan mounting medium Canada balsam (metode dimodifikasi dari Pham et al., 2003).

Hasil IHC

Kontrol positif untuk teknik pewarnaan imunohistokimia terhadap BrdU menggunakan organ thymus. Hasil pewarnaan positif pada organ thymus menunjukkan bahwa BrdU yang diaplikasikan dapat terdistribusi secara sistemik. Semua tikus yang diinjeksi BrdU pada penelitian ini menunjukkan adanya sel BrdU-Imunoreaktif  (BrdU-IR) pada thymus.

Gambar 4. Sel imunoreaktif BrdU di thymus. (A) Kontrol negatif pewarnaan (irisan hanya ditetesi pelarut antibodi) terlihat bersih tanpa adanya warna coklat dari diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) dan (B) sel imunoreaktif BrdU sebagai gambaran proliferasi sel yang terlihat berwarna coklat pada nukleus (tanda panah), counterstain hematoxylin Harris. Scale bar 10µm (Irawan, 2012).

Gambar 5. Karakteristik proliferasi sel (sel imunoreaktif BrdU) pada girus dentatus hippocampus. (A, B, C) sel-sel yang baru berproliferasi, diamati 2 jam setelah injeksi BrdU. Sel-sel terlihat pada zona sugbranular girus dentatus hippocampus dan terlihat dalam  satu cluster yang mengandung sel-sel progenitor. Tanda panah pada B dan C menunjukkan gambaran mitotik. (D, E) Sel-sel mature, diamati 4 minggu setelah injeksi BrdU. Sel berada pada lapisan granular, berbentuk bulat atau oval, sama dengan sel-sel granular, dan  terlihat non cluster (Malberg et al., 2000).

Pengamatan karakteristik proliferasi sel di formasi hippocampus (Gambar 2) oleh Malberg et al (2000) dianalisis berdasarkan sebagai berikut:

1.               Sel-sel mitotik atau yang berproliferasi, yaitu sel-sel yang terlihat dalam satu cluster

2.               Sel-sel post mitotik yaitu sel-sel bersifat non cluster.

Hasil IHC BrdU pada jaringan dalam mempelajari proliferasi sel dapat dilakukan secara deskriptif maupun dengan melakukan penghitungan sel imunoreaktif BrdU (BrdU-IR). Sel BrdU-IR yang dihitung terutama pada lapisan otak seperti pada masing-masing subregio di formasi hippokampus yaitu tiap lapisan atau stratum girus dentatus dan cornu ammonis pada tiap irisan serial dapat dievaluasi dengan Abercrombie’s correction.

Daftar pustaka

Epp, J.R., dan Galea, L.A.M., 2009. Hippocampus-dependent strategy choice predicts low levels of cell proliferation in the dentate gyrus. Neurobiology of Learning and Memory, 91:437-446.

Irawan, V., 2012. Thesis: Efek protektif ekstrak etanol pegagan (centella asiatica (l.) Urban) terhadap proliferasi sel formasi hippocampus tikus dewasa pada kondisi stres kronis. Veterinary Science, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia.

Malberg, J.E., Eisch, A.J., Nestler, E.J., dan Duman, R.S., 2000. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. The Journal of Neuroscience, 20(24):9104-9110.

Pham, K., Nacher, J., Hof, P.R., dan McEwen, B.S., 2003. Repeated restraint stress suppresses neurogenesis and induced biphasic PSA-NCAM expression in the adult rat dentate gyrus. European Journal of Neuroscience, 17:879-886.

Taupin, P., 2007. BrdU immunihistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews, 53:198-214.