ANALISA PERUBAHAN GENETIK (RAS , P53, PTEN, DAN INK4A/ARF) PADA TUMOR OTAK (MALIGNAT GLIOMA) MENCIT B6C3F1 YANG DIPAPARKAN 1,3-BUTADIENE

Pendahuluan

Tumor otak yang terjadi akibat paparan 1,3-butadiene pada mencit B6C3F1 terjadi pada bagian anterior atau lobus olfaktori berasosiasi dengan masukya 1,3-butadiene dari pernafasan dari udara dan selanjutnya melalui aliran darah menembus blood-brain barrier. Secara analisis statistik serta hasil observasi pada lokasi dan genetik spesifik  tumor otak mencit merupakan hasil induksi secara kimiawi dengan 1,3-butadiene. Karakteristik morfologi maglinant glioma ini konsisten dengan yang dilaporkan pada manusia (Kleihues and Cavenee, 2000). 

           

Paparan 1,3-butadiene pada mencit B6C3F1 menyebabkan terjadinya perubahan genetik. Pada karsinogenik terdapat beberapa tahapan aktivasi dari famili protooncogene seperti Ras dan inaktivasi pada tumor suppresor gene seperti p53 selama perkembangan neoplastik.

Analisa Perubahan Genetik Berdasarkan Hasil Sequencing

1. Analisa Perubahan Genetik Protooncogen Ras

Berdasarkan analisis genetik pada malignant glioma mencit B6C3F1 yang diekpos 1,3-butadiene oleh Kim et al. (2005) tidak terdapat  mutasi pada kodon 61 ras H maupun mutasi pada ras K.

  

Tabel 1. Analisa perubahan genetik pada mencit B6C3F1 yang dipaparkan 1,3 butadiene (Kim et al., 2015). Data menunjukkan tidak terjadi mutasi pada Ras.

Pada sel normal mamalia, protooncogene Ras terdiri dari Ras H, K, dan N yang  berperan dalam pertumbuhan dan diferensiasi sel, mengkode suatu protein yang berperan dalam transduksi sinyal yang berperan dalam mengubah secara reversible nukleotida guanin yang mempengaruhi aktivitas intrinsik GTPase (Barbaric, 1987; Trahey dan McCormick, 1987; Cales et al., 1988 ; Adari et al., 1988). Protooncogene Ras memiliki fungsi yang mempengaruhi regulasi pertumbuhan dan diferensiasi seluler. Namun Mutasi pada kodon 12, 13, 61 mengubah gen ras menjadi oncogene yang aktif mengalami amplifikasi (Barbaric, 1987). Over-ekspresi ras berpotensial menyebabkan transformasi yang berperan dalam perkembangan neoplasia (Spandidos et al., 1992). Mutasi kodon 61 berperan penting dalam perubahan konformasi protein ras yang dibutuhkan untuk mengkatalisis GTP hydrolysis (GTPase-inhibiting mutation). Protein mutan ini dapat mengikat GTPase-activating protein yang menengahi efek transduksi sinyal protein ras ke sel (Trahey dan McCormick, 1987; McCormick, 1989).

2. Analisa Perubahan Genetik p53

Terhadap protein p53, terjadi mutasi transisi yang dapat dijumpai sejak 13 minggu paparan pada gene yang mengkode p53 (protein) yaitu TP53 (Kim et al., 2005). Predominan transisi G menjadi A pada TP53 di tumor otak pada mencit yang diinduksi dengan 1,3-butadiene menyebabkan kerusakan DNA dan hal ini juga terlihat pada beberapa tumor berbeda yang mengalami mutasi akibat induksi 1,3-butadiene (Wiseman et al., 1994; Zhuang et al., 1997; Hong et al., 2000; Sills et al., 2001; Zhuang et al., 2002). 

Tabel 2. Analisa perubahan genetik pada mencit B6C3F1 yang dipaparkan 1,3 butadiene (Kim et al., 2015). Data menunjukkan terjadi mutasi p53.

Keberadaan transisi GGA→AGA, ATC→TTC, GTC→ATC diduga hal ini dikarenakan adanya misfolding dari guanine-N-7-adduct atau crosslinking DNA strand  akibat alkylating 1,3-butadiene yang secara frekuensi menyebabkan mutasi (Trukhanova et al., 1998; Melnick, 2002). Secara alternatif, mutasi transisi dapat terjadi secara spontan sebagai konsekuensi interaksi dengan karsinogen dilingkungan, seperti pada kejadian tumor astrocytic pada manusia (Kleihues et al., 1995). Dibeberapa studi, hampir 67% manusia dengan glioblastoma sekunder memiliki mutasi pada TP53, dan secara mayor mengalami mutasi transisi G menjadi A (Watanabe et al., 1996; Fulci et al., 2000). 

           

Adanya target guanin dan adenin ini konsisten dengan terbentuknya adduct N-guanine dan N-adenine akibat metabolisme 1,3-butadiene oleh sistem monooksigenase sitokrom p-450 (Hong et al., 2000). 1,3 butadine di metabolisme oleh monooksigenase sitokrom p450 menjadi epoksid reaktif yaitu 3,4-epoxybutene, 3,4-epoxy-1,2-butanediol, dan 1,2,3,4-diepoxybutane (DEB). Ketiga epoksid ini dapat mengikat DNA sehingga DEB dapat bersifat carsinogen atau genotoksin yang berkemampuan membentuk DNA adduct bifungsional dengan DNA-DNA cross-links  (Goggin et al., 2009). DEB merupakan agen alkylating yang bersifat elektofilik dan berikatan dengan pusat nukleofilik (urutan reaktivitas pusat nukleofilik yaitu N⁷-G>> N³-G > N¹-A= N3G = 0⁶-G). Agen alkylating yang bifungsional (terdapat 2 gugus alkil reaktif) dapat menyebabkan terjadinya ikatan silang antar untai yang berhadapan dalam molekul DNA. DEB bersifat alkilasi pada posisi N7 dari basa guanine DNA yang dapat membentuk N7-(2’-hydroxy-3’,4’-epoxybut-1’-yl)-guanine (N7-HEB-dG) adducts.  Grup epoksid N7-HEB-dG dapat dihidrolisis menjadi N7-(2’,3’,4’- trihydroxybut-1’-yl)-guanine (THBG) yang dapat mengikat DNA lain pada  sepeti N7 Guanin atau N1 adenin menjadi bentuk 1,4-bis-(guan-7-yl)-2,3-butanediol (bis-N7G-BD) and 1-(guan-7-yl)-4-(aden-1-yl)-2,3-butanediol (N7G-N1A-BD) cross-links  (Goggin et al., 2009). Alkilasi N⁷-G basa purin menimbulkan ketidakstabilan nitrogen kuartener, sehingga basa purin yang terakilasi dapat lepas dari deoksiribosa meninggalkan tempat yang kosong yang mengganggu proses replikasi atau menyebabkan masuknya basa yang tidak sesuai (Pranowo, 1991).

Gambar 1. Gambaran epoksid 1,3 butadine dan pembentukan DNA-DNA adduct (Goggin et al., 2009).

Analisa IHC terhadap ekspresi p53

Melalui pewarnaan IHC dijumpai adanya akumulasi p53 di otak tikus yang mengalami tumor otak malignat, seperti yang terlihat pada gambar 2 (Kim et al., 2005). Hal ini menunjukkan masih adanya aktivitas p53 untuk menghentikan siklus sel di fase G1 dengan menghasilkan p21 dan apotosis dengan menghasilkan bax dan lain-lain agar tidak memasuki fase S diakibatkan bila ada kerusakan pada DNA di sel yang harus diperbaiki atau di apoptosis. Hasil IHC ini berasosisasi dengan kejadian mutasi yang terjadi akibat paparan 1,3 butadiene yang menginduksi malignat glioma di otak.

Gambar 2. Otak: mencit B6C3F1 jantan dengan 625 ppm 1,3-butadiene sealama 26 minggu dan dibiarkan  selama 2 tahun. Malignat glioma: adanya akumulasi protein p53 (coklat) pada inti dari sel neoplastik. Metode kompleks Avidin-biotin peroxidase ntuk deteksi protein p53 dengan counterstain hematoxylin. Bar = 70 μm (Kim et al.,2005)

Gambar 3. Aktivasi p53 terjadi saat ia berikatan dengan p53RE di DNA dan meregulasi transkripsi gen, menyebabkan siklus sel tertahan atau apoptosis. MDM2,WIP1 dan cyclin G member feedback negative pada p53 dan p53 diaktifkan oleh p19 atau p14 arf sebagai feedback positif (Levine et al., 2005).

Analisis Loss of Heterozygositas (LOH) pada gen p53, pten, dan Ink4a/Arf

Tikus B6C3F1 merupakan tikus dari persilangan betina dengan allele C57BL/6 dan jantan dengan allele C3H, sehingga F1 yang dihasilkan memiliki sifat heterozygositas (2 allele yang berbeda) yaitu C57 dan C3H. Pada gen dari masing-masing allele memiliki daerah kode yaitu p53, pten dan Ink4a/Arf. Pada tumor malignat glioma dari mencit B6C3F1 yang diindukasi 1,3-butadiene dilakukan analisis Loss of Heterozygositas (LOH) dimana analisis ini menunjukkan kehilangan fungsi normal suatu gen (p53, pten, dan Ink4a/Arf) dari masing-masing allele (C3H dan C57) (Kim et al., 2005).

1. Analisis Loss of Heterozygositas (LOH) pada gen p53

Hasil analisa LOH memperlihatkan: pada gen p53 dijumpai hilangnya allele C3H(H) dan kehilangan parsial alel C57(B) (Kim et al., 2005). Hasil ini menunjukkan terjadi mutasi pada gen p53 yang juga ditemukan pada hasil sequencing.

Gambar 4. Analisis Loss of Heterozygosity (LOH) terhadap gene p53 pada tumor otak dari mencit B6C3F1 yang diekspos dengan 1,3-butadiene. Analisis digunakan primer PCR terhadap mikrosatelit marker D11Mit320 near p53. Sampel 3# (malignant glioma) menunjukkan hilangnya wild-type allele C3H. Sampel 4# (malignat glioma) terlihat kehilangan secara parsial wild-type pada allele C57BL/6. (Kim et al.,2005).

Tabel 3. Analisis Loss of Heterozygositas (LOH) pada gen p53 mencit B6C3F1 yang dipaparkan 1,3 butadiene. Data menunjukkan terjadi mutasi p53 dimana pada gen p53 dijumpai hilangnya allele C3H(H) dan kehilangan parsial alel C57(B) (Kim et al., 2015).

TP53 secara normal berfungsi menghasilkan protein p53 sebagai inhibitor untuk proses replikasi seluler ketika DNA mengalami kerusakan serta berperan dalam apoptosis sebagai faktor transkripsi melalui peranannya dalam siklus sel. Perubahan struktur pada gen yang bermutasi mempengaruhi kemampuan protein untuk mengikat DNA dalam proses replikasi sel. Sel yang mengalami kerusakan DNA secara genetik tidak stabil untuk replikasi (Vogelstein et al., 1992). Mutasi pada gene TP53 menyebabkan hilangnya kontrol terhadap pertumbuhan sehingga terjadi proliferasi terhadap neoplastic astrocytes (Rasheed et al., 1994).

Perubahan protein p53 menyebabkan deregulasi kontrol siklus sel pada G₁ yang dapat menurunkan proses apoptosis sel tumor sehingga terjadi ketidakseimbangan aktivitas proliferasi dan penurunan apoptosis sehingga sel tumor menjadi agresif (Harris, 1996; Trukhanova et al., 1998). DNA binding domain (DBD) merupakan bagian penting untuk p53 untuk dapat berikatan dengan sequence gen. Adanya mutasi menyebabkan terjadinya DBD residues yang dapat mempengaruhi ikatan langsung dengan DNA. mutasi protein p53 menyebabkan tertekannya kemampuan p53 untuk berikatan dengan sequence DNA target, DBD-p53 mutan dapat menghambat apoptosis, terjadi resisten apoptosis, dan mengganggu fungsi p53 dalam mencegah transformasi ras. p53 mutant juga mengaktifkan proliferating  cell nuclear antigen (PCNA), human epidermal growth factor receptor (EGFR), dll (Sigal dan Rotter, 2005).

           

2. Analisis Loss of Heterozygositas (LOH) pada gen PTEN

Hasil analisa LOH tidak memperlihatkan terjadinya LOH pada pten (Kim et al., 2005). Seperti TP53, PTEN/MMAC1 (phosphatase and tensin homolog/ mutated in multiple advanced cancers 1) merupakan tumor suppressor gene. Inaktivasi pten merupakan tahapan yang penting dalam progresif glioma dan tahapan lanjut glioblastoma multiforme. PTEN berfungsi menghambat pertumbuhan sel melalui sinyal transduksi protein kinase B. Mutasi akan menyebabkan eliminasi aktivitas lipid phosphatase pten yang akan mereduksi kemampuannya dalam menekan pertumbuhan sel (Furnari et al., 1998). Namun dalam hal ini PTEN tidak mengalami mutasi (Kim et al., 2005), hal ini menunjukkan pten tidak atau belum terpengaruh oleh paparan 1,3 butadiene sehingga masih dapat berfungsi dengan baik sebagai tumor suppressor gene untuk melawan perkembangan tumor otak yang sedang berlangsung.

Tabel 3. Analisis Loss of Heterozygositas (LOH) pada gen pten mencit B6C3F1 yang dipaparkan 1,3 butadiene. Data tidak memperlihatkan terjadinya LOH pada pten (Kim et al., 2015).

3. Analisis Loss of Heterozygositas (LOH) pada Ink4a/Arf

Pada Ink4a/Arf dijumpai hilangnya alel C57(B). Hasil ini menunjukkan hilangnya heterozigositas pada Ink4a/Arf yang dapat dikarenakan mutasi akibat sifat genotoksik dari 1,3-butadine (Kim et al., 2015). Ink4a/Arf secra normal merupakan gen yang mengkode suatu protein yang dapat mempengaruhi aktivitas protein retinoblastoma (pRb) yang meregulasi keluar dari G1 siklus sel dan mempengaruhi aktivitas protein p53 dalam proses pertumbuhan atau regulasi sel. Gen ini mengkode protein  p16^Ink4a (p16) yang mempengaruhi jalur pRb dan p14/p19ARF (ARF) yang mempengaruhi jalur p53 (Levine, 1997).

Tabel 4. Analisis Loss of Heterozygositas (LOH) pada gen Ink4a/Arf mencit B6C3F1 yang dipaparkan 1,3 butadiene. Data memperlihatkan hilangnya heterozigositas pada Ink4a/Arf yang dapat dikarenakan mutasi akibat sifat genotoksik dari 1,3-butadine (Kim et al., 2015).

P16 merupakan famili protein inhibitor cyclin-dependent kinase 4 (INK4) yang memiliki kemampuan untuk berikatan dengan CD4 dan CD6. INK4 menghambat ikatan antara CDK4/6 terhadap ikatan ATP-binding site (menghambat aktivitas kinase CDK4/6 atau  ikatan CDK4-cyclin D) dalam memfosforilasi pRb yang akan membebaskan ikatan prb-E2F.  E2F merupakan faktor transkripsi yang mengenali spesifik sequence DNA dimana meregulasi sejumlah gene yang dibutuhkan untuk sintesis substrat prekusor sintesis dan replikasi DNA. Sehingga dengan adanya p16-CDK4, pRb tidak terfosforilasi, tetap ada ikatan pRb-E2F, dan E2F tertahan untuk masuk ke fase S (Russo et al., 1998; Brotherton et al., 1998). Ekspresi pRb penting untuk transduksi sinyal p16 untuk pemberhentian sementara siklus sel. Absen pRB menginduksi p16 untuk tidak terjadinya pemberhentian siklus sel. Sehingga pada kasus tumor  terutama glioma, terjadi perubahan jalur p16-cyclinD-CDK4-pRb, dimana tidak ada ekpresi pRb  atau terjadi overekspresi CDK4 atau cyclin D1 (Ueki et al., 1996).           

           

p14/p19ARF memiliki kemampuan dalam menginduksi pemberhentian siklus sel pada G2/M seperti halnya G1/S. Tertahannya pertumbuhan diinduksi oleh ARF tergantung pada aktivitas p53. Peningkatan p53 secara signifikan merespon untuk meningkatkan ekpresi ARF yang mempengaruhi keseimbangan antara transkripsi p53 dan degradasinya. Tidak seperti p16, ARF tidak mengikat CDKs.  ARF berinteraksi dengan MDM2. Apabila MDM2 berikatan dengan p53 akan membawa p53 ke proteosome untuk didegradasi). Adanya ARF yang mengambat MDM2, ekpresi p53 menjadi stabil, dan fungsi p53 sebagai faktor transkpsi meningkat (Stacey et al., 2001). ARF dapat mengikat MDM2 pada kondisi adanya mutasi Ras agar p53 dapat bekerja sebagai tumor suppressor namun bila ARF mengalami mutasi ia tidak dapat berikatan dengan MDM2 sehinffa p53 berikatan dengan MDM2 dan didegradasi.

Gambar 5. Pengaruh protein  p16^Ink4a (p16) terhadap jalur pRB dan p14/p19ARF (ARF) terhadap jalur p53. p16 akan mengikat CDK4 (kompetisi terhadap ikatan CDK4-cyclin D) agar tidak terjadi fosforilasi pRB sehingga E2F1 tertahan difase G1 dan tidak masuk ke fase S. Kemudian ARF akan mengikat MDM2 untuk mencegah degradasi p53 sehingga p53 dapat menjalankan fungsinya sebagai  faktor transkripsi dengan menghasilkan bax untuk apoptosis atau p21 untuk menghambat masuk ke fase S dan tetap di G1(Stacey et al., 2001).

Gambar 6.  Gambaran siklus sel dimana pada fase G1 terjadi sintesis RNAs dan protein untuk persiapan sintesis DNA dan replikasi kromosom di fase S (sintesis), kemudian masuk ke fase G2 dimana sudah terdapat sister chromatid, selanjutnya terjadi proses yang kompleks yaitu mitosis yang disebut fase M (mitotic) yang dibagi menjadi beberapa tahapana yaitu metafase, anaphase, telofase,  cytokinesis yang membagi menjadi daughter sel. Sel yang tidak mengalami prolliferasi akan meninggalkan G1 masuk ke G0 (Abrous et al., 2005).

Gambar 7. Aktivitas oncogen seperti ras akan memicu INK4a/p16 dan ARF. INK4a/p16 akan menghambat CDK4/D1 sehingga menghambat fosforilasi Rb, dan ARF akan menghambat MDM2 sehingga menghambat degradasi p53. Akibatnya sel mengalami perhentian sementara atau dapat juga terjadi apoptosis yang menunjukkan sebagai respon antiproliferasi. Namun bila ada stimulus oncogen tapi gen p53 dan  INK4a/p16  mengalami mutasi, maka tidak terjadi penahanan siklus sel di G1 melainkan masuk ke fase S dan terjadi replikasi DNA dan seterusnya sehingga terjadi proliferasi sel yang dijumpai pada sel tumor (Stacey et al., 2001).

           

Adanya perubahan atau mutasi dari Ink4a/Arf menyebabkan p16 tidak menghambat fosforilasi dari pRb serta ARF tidak menghambat MDM2 untuk degradasi p53, sehingga absen pRb dan p53, akibatnya tidak terjadi penahanan siklus sel di G1, dan sel masuk ke fase S dimana  terjadi replikasi DNA dan seterusnya sehingga terjadi proliferasi sel pada sel tumor.

Kesimpulan

Perubahan genetik yang terjadi seperti mutasi p53, ras H, Ink4a/Arf pada mencit B6C3F1ayang diinduksi 1,3 butadiene  menunjukkan adanya kemiripan pada tumor yang terjadi pada manusia dan diduga adanya peran dari ekpos egen penyebab dari lingkungan terhadap neurokarsinogenesis pada manusia.  Tidak  atau belum terjadinya mutasinya PTEN dan adanya akumulasi p53 sebagai tumor suppressor menunjukkan masih adanya respon tubuh terhadap kerusakan DNA dan tumor yang terjadi.

Daftar Pustaka

Abrous,D.N., Muriel Koehl, And Michel Le Moal, 2005. Adult Neurogenesis: From Precursors To Network And Physiology Physiol Rev 85: 523–569.

Adari H, Lowy DR, Willumsen BM, Der CJ, Mccormick F Guanosine, 1988. Triphosphatase Activating Protein (GAP) Interacts With The P21 Ras Effector Binding Domain. Science 240518.

Barbacid M: Ras Genes.1987, Ann Rev Biochem 56:779

Brotherton DH, Dhanara V, Wick S, Brizuela L, Domaille PJ, Volyanik E, Xu X, Parisini E, Smith BO, Archer SJ, 1998. Crystal Structure Of The Complex Of The Cyclin D-Dependent Kinase Cdk6 Bound To The Cell-Cycle Inhibitor P19ink4d. Nature 395: 244–50.

Cales C, Hancock JF, Marshall CJ, Hall A, 1988. The Cytoplasmic Protein GAP Is Implicated As The Target For Regulation By The Ras Gene Product. Nature 332548.

Furnari, F.B., Huang, H.S., And Cavenee, W.K. 1998. The Phosphoinositol Phosphatase Activity Of PTEN Mediates A Serum-Sensitive G1 Growth Arrest In Glioma Cells. Cancer Res. 58, 5002–5008.

Furnari, F.B., Fenton, T., dan Bachoo, R.M., et al., 2007. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes Dev. 21:2683-710.

Goggin,M., James A. Swenberg, Vernon E. Walker,and Natalia Tretyakova1. 2009 Molecular Dosimetry Of 1,2,3,4-Diepoxybutane–Induced DNA-DNA Cross-Links In B6C3F1 Mice And F344 Rats Exposed To 1,3-Butadiene By Inhalation Cancer Res. 69: (6).

                                                                            

Harris CC, 1996. Structure And Function Of The P53 Tumor Suppressor Gene: Clues For Rational Cancer Therapeutic Stratagies. J. Natl. Cancer Inst. 88: 1442 1455.

Hong, H. H., Devereux, T. R., Melnick, R. L., Moomaw, C. R., Boorman, G. A., and Sills, R. C., 2000. Mutations of ras protooncogenes and p53 tumor suppressor gene in cardiac hemangiosarcomas from B6C3F1 mice exposed to 1,3-butadiene for 2 years. Toxicol Pathol 28, 529–34.

Kleihues, P., Aguzzi, A., and Ohgaki, H. (1995). Genetic and environmental factors in the etiology of human brain tumors. Toxicol Lett 82–83, 601–5.

Kim, Y., Hong, HH., Lachat, Y., Clayton, N.P., Devereux, T.R., Melnick, R.L., Hegi, M.E, dan Sills, R.C., 2005. Genetic alterations in brain tumors following 1,3-butadiene exposure in B6C3F1 mice. Toxicol Pathol., 33(3):307-12.

Levine AJ, 1997. P53, The Cellular Gatekeeper For Growth And Division. Cell 88: 323–31.

Levine,  A.J, Jill Bargonetti, Gareth L. Bond, Josephine Hoh, Kenan Onel, Michael Overholtzer, Archontoula Stoffel, Angelica K. Teresky, Christine A. Walsh, dan Shengkan Jin, 2005 Mutantszambetti, Gerard P. The P53 Tumor Suppressor Pathway And Cancer/Gerard P. Zambetti. P. Cm. (Protein Reviews). Springer Science Business Media, Inc.: Singapore

Mccormick. F. 1989. Ras Gtpase Activating Protein: Signal Transmitter And Signal Terminator. Cell, 56: 5-8.

Melnick, R. L., and Huff, J. (1992). 1,3-Butadiene: toxicity and carcinogenicity in laboratory animals and in humans. Rev Environ Contam Toxicol 124, 111–44.

Rasheed,, B.K, Mclendon, R.E.,  Herndon, J.E., Friedman, H.S., Friedman, A.H., Bigner, D.D, Dan Bigner, S.H., 1994. Alterations Of The TP53 Gene In Human. Cancer Research 54, 1324-1330

Russo AA, Tong L, Lee JO, Jeffrey PD, Pavletich NP, 1998. Structural Basis For Inhibition Of The Cyclin-Dependent Kinase Cdk6 By The Tumour Suppressor P16ink4a. Nature 395: 237–43.

Spandidos, D.A., Karaiossifidi, H., Malliri, A., Linardopoulos, S., Vassilaros, S., Tsikkinis, A., dan Field, J.K., 1992. Expression of ras Rb1 and p53 proteins in human breast cancer. Anticamcer Re., 12(1):81-89.

Stacey M. Ivanchuk, Soma Mondal, Peter B. Dirks And James T. Rutka, 2001.The INK4A/ARF Locus: Role In Cell Cycle Control And Apoptosis And Implications For Glioma Growth Journal Of Neuro-Oncology 51: 219–229.

Sills, R. C., Hong, H. L., Boorman, G. A., Devereux, T. R., and Melnick, R. L. (2001). Point mutations of K-ras and H-ras genes in forestomach neoplasms from control B6C3F1 mice and following exposure to 1,3- butadiene, isoprene or chloroprene for up to 2-years. Chem Biol Interact 135–136, 373–86.

Sigal, A and V. Rotter, 2005. The Oncogenic Activity Of P53 Mutantszambetti, Gerard P. The P53 Tumor Suppressor Pathway And Cancer/Gerard P. Zambetti. P. Cm. (Protein Reviews). Springer Science Business Media, Inc.: Singapore

         

Trahey M, Mccormick F A, 1987. Cytoplasmic Protein Stimulates Normal N-Ras P21 Gtpase, But Does Not Affect Oncogenic Mutants. Science 238542.

Ueki K, Ono Y, Henson JW, Efird JT, Von Deimling A, Louis DN, 1996. CDKN2/P16 Or RB Alterations Occur In The Ma Ority Of Glioblastomas And Are Inversely Correlated. Cancer Res 56: 150–3.

Vogclstein. B., Dan Kinzler, K. W., 1992.  P53 Function And Dysfunction. Cell,   70: 523-526.

Watanabe K, Tachibana O, Sata K, Yonekawa Y, Kleihues P, dan Ohgaki H., 1996. Overexpression of the EGF receptor and p53 mutations are mutually exclusive in the evolution of primary and secondary glioblastomas. Brain Pathol. 6:217- 23.

Zhuang, S. M., Wiseman, R. W., and Soderkvist, P. (2000). Mutation analysis of the pRb pathway in 2_,3_-dideoxycytidine- and 1,3-butadiene-induced mouse lymphomas. Cancer Lett 152, 129–34.

                                  

Zhuang, S. M.,Wiseman, R.W., and Soderkvist, P. (2002). Frequent mutations of the Trp53, Hras1 and beta-catenin (Catnb) genes in 1,3-butadiene-induced mammary adenocarcinomas in B6C3F1 mice. Oncogene 21, 5643– 8.