IHC PART 3: NORMAL SERUM DAN IMMUNOFLUORESCENE

-
NORMAL SERUM

Normal serum merupakan blocking reagent yang umum digunakan pada teknik IHC. Tujuan aplikasi normal serum pada prosedur IHC adalah untuk mengikat ikatan non spesifik. Sebelum kita menggunakan antibody untuk mendeteksi antigen pada jaringan, ikatan non spesifik pada jaringan harus kita blok untuk mencegah antibody berikatan dengan epitope yang non spesifik. Aplikasi antibody primer bersifat spesifik sehingga antibody primer akan berikatan dengan epitope yang ditargetkan, tetapi antibody sekunder bersifat non spesifik sehingga dapat berikatan dengan ikatan non spesifik yang ada di jaringan selain berikatan dengan antibody primer. Normal serum diaplikasikan sebelum penggunaan antibody primer. Setelah jaringan diaplikasikan dengan normal serum, jaringan ditetesi dengan antibody primer tanpa proses pencucian sebelumnya. Spesies normal serum yang digunakan adalah sama dengan antibody sekunder. Bila normal serum yang digunakan adalah goat normal serum maka antibody sekunder yang digunakan adalah biotinylated goat secondary antibody.


Gambar 1. Blocking background dengan normal serum (nonimmune serum). Aplikasi normal serum dapat mencegah antibody untuk berikatan dengan epitope yang tidak kita inginkan (non specific epitope).


IMMUNOFLUORESCENCE
Teknik pewarnaan secara immunofluorescence berprinsipkan atas ikatan antigen antibody yang dilabel dengan fluorochrome (pewarna fluorescence). Protokol immunofluorescence sama dengan protocol IHC hanya saya pelabelnya yang berbeda. Teknik immunofluorescence juga dapat dibedakan menjadi direct immunofluorescence dan indirect immunofluorescence. Direct immunofluorescence menggunakan antibody yang terkonjugasi dengan fluorochrome (fluorochrome-conjugated antibody) sedangkan indirect immunofluorescence menggunakan antibody sekunder (antibody yang bersifat anti dari antibody primer). Antibody sekunder yang digunakan adalah antibody yang terkonjugasi dengan fluorochrome (fluorochrome-conjugated secondary antibody) ataupun antibody yang terbiotinilasi (biotin-conjugated secondary antibody). Pada penggunaan biotin-conjugated secondary antibody, fluorochrome akan berikatan avidin maupun streptavidin dimana avidin atau streptavidin ini akan berikatan dengan biotin pada antibody sekunder. Keuntungan teknik indirect immunofluorescence adalah kita dapat meningkatkan jumlah fluorophore (Zola, 1998).

Gambar 2. Teknik immunofluorescence. A: direct immunofluorescence, B: indirect immunofluorescence (fluorochrome-conjugated secondary antibody), C: indirect immunofluorescence (biotin-conjugated secondary antibody + avidin / streptavidin-flourescein) (Zola, 1998).  


Berikut adalah fluorophore beserta data absorpsi dan emisi pada fluorescence.
Tabel 1. Fluorophore beserta data absorpsi dan emisi pada fluorescence


Prosedur immunofluorescence memiliki kelebihan pada prosedur multi-labelling. Dalam satu jaringan dengan satu prosedur pewarnaan kita dapat melabel 2 atau lebih antigen. Double labelling dapat dilakukan dengan syarat spesies antibody primer yang digunakan adalah berbeda, misalnya antibody A dalam mouse dan antibody B dalam rabbit.


Gambar 3. Doubel immunofluorescence (Vector Laboratories, Inc. 2005)


Gambar 4. Prosedur double immunofluorescence. Pada teknik double labelling di atas menggunakan dua avidin conjugate yaitu: fluorescein avidin DC (hijau) dan texas red avidin DCS (merah) (Vector Laboratories, Inc. 2005)



Gambar 5. Pewarnaan double immunofluorescence. Pada teknik double labelling di atas menggunakan rabbit polyclonal anti-P antibody virus rabies (P), Mab 62B5 anti-N antibody virus rabies (N) dan polyclonal anti-M antibody virus rabies (M). DAPI (biru) digunakan untuk mewarnai nuclei (merge). Colocalization bewarna kuning (merge). Pengamatan menggunakan confocal laser microscopy (Lahaye et al., 2009).

Daftar Pustaka
Lahaye. X., 2009. Aurore Vidy, Carole Pomier, Linda Obiang, Francis Harper, Yves Gaudin, and Danielle Blondel Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication, Journal of virology, p. 7948–7958

Zola. H., 1998. Detection of Cytokine Receptors by Flow Cytometry. Current Protocols in Immunology . http://www.currentprotocols.com/protocol/im0621

Vector Laboratories, Inc. 2005. DISCOVERY through color A Guide to Multiple Antigen Labeling http://www.vectorlabs.com

Postingan populer dari blog ini

Metabolisme Zinc Pada Manusia Dan Hewan (Anjing & Kucing)

-
Gambar
Dietary Zinc Pada Manusia, Zinc tidak disimpan di dalam tubuh sehingga dietary intake zinc secara konstan adalah hak yang essential.  Tabel 1. Kebutuhan zinc pada manusia Pada anjing dan kucing, zinc tersedia dan disimpan di jaringan tubuh Tabel 2. Kebutuhan zinc pada anjing Tabel 3.   J umlah kandungan zink dalam makanan Zinc secara normal didapat dari daging merah dan protein hewani lainnya, namun kandungan zink yang ditemui tidak dalam jumlah yang tinggi. Zinc yang terikat dengan ligan akan memfasilitasi untuk absorpsi. Pada kebanyakan tumbuhan seperti jagung dan beras tidak berfungsi sebagai sumber zinc. Pada tumbuhan terdapat pytate yang dapat menhambat absorosi zinc karena terjadinya chelated zinc. Tingginya insidensi defisiensi zink\c dapat terjadi akibat diet protein hewan yang rendah, mengkonsumsi banyak pytate, serta rendahnya kandungan zinc di tanah. Keseimbangan Zinc (Zn) Homeostatis zinc dipengaruhi oleh absorpsi eksogen...
Baca selengkapnya

PROSEDUR HISTOLOGI: PEMBUATAN BLOK PARAFFIN DAN PEMOTONGAN

-
Gambar
Pembuatan blok paraffin merupakan prosedur histologi lanjutan setelah melakukan  koleksi sampel . Koleksi sampel dapat dilakukan secara perfusi. Berikut adalah contoh pembuatan blok paraffin pada otak tikus beserta pemotongan preparat secara serial menggunakan mikrotome Pembuatan blok parafin preparat otak Irisan otak dimasukkan ke dalam kain kasa, didehidrasi dengan direndam  dalam larutan etanol bertingkat yaitu 70%, 80%, 90%, 100%, 100% dan 100%  masing-masing selama 60 menit pada suhu kamar. Proses selanjutnya dilakukan penjernihan ( clearing ) menggunakan  xylol  selama 15 menit pada suhu kamar sebanyak tiga kali. Setelah proses  clearing , dilakukan proses infiltrasi dengan parafin cair sebanyak 3 kali pemindahan masing-masing 60 menit dalam inkubator suhu 60 ºC. Jaringan kemudian dibenamkan atau ditanam di dalam parafin cair dan didinginkan pada suhu kamar sehingga menjadi blok parafin.  Gambar 1. Otak yang dikoleksi kemudian dipr...
Baca selengkapnya

Ultrasonography (Usg) dan Aplikasinya Pada Pemeriksaan Organ Reproduksi Serta Diagnosa Kebuntingan & Foetal Sexing Pada Ternak

-
Gambar
Ultrasonography (USG) digunakan sebagai alat diagnose pada sistem reproduksi betina dan memiliki nilai ekonomis untuk menentukan kebuntingan awal pada ternak (DesCôteaux et al., 2006a). Pada artikel ini dibahas tentang prinsip dasar USG, tipe USG, komponen USG, gambaran USG dari organ reproduksi serta diagnose kebuntingan & foetal sexing pada ternak. PRINSIP DASAR USG Gambaran USG terbentuk dari intensitas gelombang suara yang dipantulkan kembali oleh jaringan kepada probe (transducer). Berdasarkan kekuatan intensitas tersebut dapat dievaluasi bentuk, kontur, ukuran serta posisi dari struktur yang dipelajari. Struktur echogenic terbentuk dari pantulan gelombang suara yang tervisualisasi sebagai warna putih hingga abu-abu pada monitor, sedangkan struktur yang tidak bersifat echoes ( anechogenic ) seperti cairan folikel akan mentransmisikan gelombang sehingga tervisualisasikan sebagai warna hitam (DesCôteaux et al., 2006a). Gambar 1. Terminologi echotexture. Jarin...
Baca selengkapnya