Perubahan Patologi Pada Kajian Eksperimental SARS-CoV-2 Pada Monyet (Rhesus Macaques)

SARS-CoV-2 merupakan virus terbaru dari coronavirus yang menyebabkan terjadinya pandemic pada Maret 2020, dimana penyakit ini dikenal sebagai COVID 19. Penelitian infeksi SARS-CoV-2 yang dilakukan pada hewan model akan membantu dalam memahami pathogenesis penyakit serta pengembangan pengujian obat dan sebagainya. Salah satu hewan model yang digunakan adalah monyet yaitu rhesus macaques (Macaca mulatta).

1. Penelitian oleh Munster et al. 2020

• Rhesus macaques dewasa digunakan sebagai hewan coba untuk model infeksi SARS-CoV-2 dimana hewan diinokulasi isolat nCoV-WA1-2020 dengan dosis 2.6x10⁶  TCID50 melalui intratracheal, intranasal dan oral. 
• Satu hari setelah inokulasi (post inoculation, p.i), hewan menunjukkan perubahan pola pernafasan, piloereksi, penurunan nafsu makan, postur membungkuk, pucat dan dehidrasi. Tanda-tanda ini bertahan hingga seminggu.
• Hewan juga mengalami peningkatan suhu pada hari ke-1 p.i, namun kembali normal pada hari berikutnya.
• Hewan direkodkan mengalami penurunan berat badan. 
• Hewan kembali pulih antara hari 9 hingga 17 p.i. 
• Radiografi menunjukkan infiltrasi pulmonari ringan bermula pada hari ke-1 p.i pada lobus pulmo bagian bawah. Selanjutnya hari ke-3 p.i, terjadi progress infiltrasi pulmonari ringan pada lobus pulmo yang lain terutama pada bagian caudal. Infiltrasi pulmonari terlihat dari hari 1 hingga 12 p.i. Infiltrasi pulmonari moderat terlihat pada hari ke-3 hingga ke-7 p.i pada lobus pulmo bagian atas. Infiltrasi yang sempat hilang namun muncul kembali pada hari ke-10 p.i. Namun terlihat adanya tanda-tanda kembali normal setelah  hari ke-14 p.i.  

• Analisa hematologic menunjukkan terjadinya stress leukogram pada hari ke-1 p.i yaitu dengan adanya leukocytosis, neutrophilia, monocytosis dan lymphopenia. Level lymphocyte dan monocyte kembali pada level baseline setelah 1 hari p.i. Level neutrophils menurun pada hari ke-3 p.i hingga hari ke-10 p.i dan kemudian kembali ke level baseline. Hematocrit, sel darah merah, persentase reticulocyte dihitung sejak hari ke-1 p.i dan terus menurun hingga hari ke-5 p.i. Hewan juga mengalami normocytic, normochromic non-regenerative anemia yang konsisten. Namun kondisi anemia sedikit demi sedikit menjadi lebih baik namun tidak mencapai level baseline hingga hari ke-21 p.i. 
• Analisa serum menunjukkan peningkatan level cytokin dan chemokin. Satu hari p.i terjadi peningkatan IL1ra, IL6, IL10, IL15, MIP-1b. Pada hari ke-3 p.i terjadi sedikit penurunan TGFα. 
• Viral load ditemukan pada swab hidung, tenggorokan dan rectal. Namun RNA virus tidak dideteksi pada darah maupun urin yang dikoleksi dari hari ke -3 hingga hari ke-21 p.i. Diduga saluran pernafasan merupakan tempat utama untuk virus bereplikasi. 
• Perubahan patologi menunjukkan adanya lesi multifocal pada pulmo yang bersifat lemah hingga moderat, terjadinya peningkatan rasio berat pulmo:berat badan yang mengindikasikan terjadinya edema.

• Hasil histologi menunjukkan terjadinya intestitial pneumonia pada bagian central dan terminal dari bronchioles. Gambaran pneumonia berupa penebalan septae dari alveolar akibat cairan edema dan fibrin serta adanya macrophages dan neutrophil. Alveoli dipenuhi oleh sejumlah pulmonary macrophages dan neutrophil. Pada pulmo dengan perubahan yang moderat dijumpai adanya edema dan fibrin dengan pembentukan membran hyaline. Hanya sedikit hyperplasia dari type II pneumocyte. Bronchioles menunjukkan terjadinya necrosis, kehilangan ataupun pelemahan dari epithelium dengan adanya infiltrasi neutrophil, macrophages dan eosinophil. Terbentuknya perivascular cuff dimana perivascular diinfiltrasi oleh sejumlah kecil dari lymphocytes. Pada infeksi kronis, pembuluh darah kecil diselingi oleh pembentukan mature collagen.
• Hasil immunohistokimia (IHC) dengan menggunakan mAb terhadap SARS-CoV untuk melihat keberadaan antigen virus menunjukkan antigen virus ditemukan pada sejumlah kecil dari type I dan II pneumocyte, alveolar dan macrophage. Antigen-positive macrophage ditemukan pada nodus limfatikus mediastinal (mediatinal lymh nodes). Selain itu sejumlah kecil antigen-positive lymphocyte dan antigen-positive macrophage juga ditemukan pada lamina propia dari saluran intestinal. Antigen-positif mononuclear cell juga ditemukan pada saluran gastrointestinal.

2. Penelitian oleh Bao et al. 2020

• Penelitian oleh Bao et al. 2020 bertujuan melihat kondisi hewan apabila dilakukan infeksi kembali oleh SARS-CoV-2 (rechallenged) setelah hewan mengalami pemulihan (early recovery phase).
• Rhesus macaques berumur 3 dan 5 tahun digunakan sebagai hewan coba untuk model infeksi SARS-CoV-2 dimana hewan diinokulasi isolat SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN dengan dosis 10⁶  TCID50/1 mL melalui intratracheal. Setelah hewan mengalami pemulihan, hewan diinokulasi kembali dengan dosis virus yang sama yaitu pada hari ke-28 p.i. 
• Hewan yang mengalami infeksi pertama tanpa infeksi kembali akan dieuthanasi pada hari ke-21 dan ke-28 p.i. Selanjutnya untuk grup hewan yang dilakukan infeksi pertama kemudian dilakukan infeksi kembali (rechallenged) akan dieuthanasi pada hari ke 33 dan 42 p.i.
• Pada infeksi pertama, hewan mengalami penurunan berat badan, namun tiada monyet yang mengalami peningkatan suhu (rectal temperature). Hewan juga mengalami penurunan nafsu makan serta peningkatan respirasi. Pada infeksi pertama ini hewan mengalami peningkatan sel darah putih seperti neutrophil dan lymphocyte, sedangkan T lymphocyte CD4T dan CD8T relatif stabil. Spesifik antibodi terhadap SARS-CoV-2 juga meningkat dengan signifikan lebih tinggi pada hari ke-21 p.i bila dibandingkan hari ke-3 p.i. 
• Hasil radiologi pada infeksi pertama menunjukkan hewan mengalami pneumonia dengan terlihat adanya bilateral ground-glass opacities yang menunjukkan adanya infiltrasi pada area intestitial yang ringan hingga moderat.
• Pada infeksi pertama ini juga terdeteksi viral RNA copies pada spesimen yang di nekropsi seperti hidung (10⁶  menjadi 10⁸ copies/mL), pharynx  (10⁴  menjadi 10⁶ copies/mL), pulmo  (10³  menjadi 10⁷ copies/mL) dan usus  (10⁴  menjadi 10⁶ copies/mL).
• Gambaran histologi pada infeksi pertama ditemui adanya intestitial pneumonia yang bersifat ringan hingga moderat berupa pelebaran septae dari alveolar, peningkatan alveolar macrophage dan lymphocyte pada alveolar intestitium, terjadinya degenerasi epitel alveolar serta infiltrasi sel-sel radang pada pulmo monyet yang mengalami infeksi pertama. Selain itu juga terjadi peningkatan serabut kolagen yang menyebabkan penebalan alveolar intestitium. Membran mukosa dari trakea, tonsil, nodus limfatikus pulmonary (pulmonary lymph nodus), jejenum dan kolon memperlihatkan adanya infiltrasi sel-sel radang. 
• Melalui gambaran IHC pada monyet yang mengalami infeksi pertama terlihat keberadaan yang berlimpah dari CD4T dan CD8T, sel B, macrophages dan sel plasma pada pulmo. Virus yang menginfeksi sel terutama ditemukan pada epitel alveolar dan macrophage., begitu juga pada membran mukosa trakea, tonsil, nodus limfatikus pulmonary (pulmonary lymph nodus), jejenum dan kolon.
• Hari ke 15 p.i, berat badan monyet mulai meningkat. 
• Hari ke-28 melalui gambaran x-ray dada menunjukkan kondisi yang normal, tiada gejala klinis serta deteksi negatif dari 2 kali pengujian RT-PCR, sehingga pada hari ke-28 dilakukan infeksi kembali.
• Pada infeksi kembali (rechalleged), hewan mengalami peningkatan suhu tubuh yang tidak terjadi pada infeksi pertama.  Namun virus load adalah negatif selama 2 minggu pengujian secara intensif melalui swab nasopharyngeal dan anal pada hewan yang diinfeksi kembali. Pada hari ke-33 p.i tidak ditemukan adanya abnormalitas dari hasil x-ray. Namun ada peningkatan antibodi terhadap SARS-CoV-2 yang signifikan pada hari ke-42 p.i bila dibandingkan dengan hari ke-28 p.i. Melalui pengujian dari spesimen hasil nekropsi tidak ditemukan RNA virus, tidak ada perubahan lesi pathological yang signifikan, tidak ada ditemukan sel yang terinfeksi virus, dan tidak ada infiltasi sel-sel imun pada pulmo dan jaringan ekstrapulmonari pada monyet yang diinfeksi kembali pada fase awal pemulihan. 

• Pada monyet yang mengalami infeksi kembali (rechalleged) dengan SARS-CoV-2 (virus yang sama/identik) tidak terdeteksi penyebaran virus, tidak menunjukkan manifesto gejala klinis, dan tidak mengalami perubahan histophalogical. Adanya peningkatan neutralizing antibody diduga berkontribusi untuk melindungi monyet dari infeksi kembali oleh SARS-CoV-2. 

     

referensi:

Munster VJ, Feldmann F, Williamson BN, van Doremalen N, P
erez-P
erez L, Schulz J, Meade-White K, Okumura A, Callison J, Brumbaugh B, et al. 2020. Respiratory disease and virus shedding in rhesus macaques inoculated with SARS-CoV-2. Nature. doi: 10.1038/s41586-020-2324-7. 

Bao, L., Deng, W., Gao, H., Xiao, C., Liu, J., Xue, J., Lv, Q., Liu, J., Xu, Y., Qi, F., Qu, Y., Li, F., Xiang, Z., Yu, H., Gong, S., Liu, M., Wang, G., Wang, S., Song, Z., Liu, Y., Zhao, W., Han, Y., Zhao, L., Liu, Z., Wei, Q., and Qin, C. 2020. Lack of reinfection in rhesus macaques infected with SARS-CoV-2. https://doi.org/10.1101/2020.03.13.990226