GAMBARAN PATOLOGI DAN PERUBAHAN GENETIK PADA TUMOR OTAK (MALIGNAT GLIOMA) MELALUI PAPARAN 1,3-BUTADIENE PADA MENCIT B6C3F1

Pendahuluan

Sepuluh dari 500 studi National Toxicology Program (NTP) menunjukkkan hasil yang kurang jelas dari efek karsinogenik pada otak mencit F344 brain (Melnick and Huff, 1992; Sills et al., 1999). Dan sistem syaraf pada  mencit B6C3F1 belum pernah dijadikan target untuk karsinogenik secara kimiawi pada pengujian di NTP (Sills et al., 1999). Terdapat 1 spontaneous malignat glioma yang ditemukan pada 1100 kamar tikus (jantan) pada studi NTP, namun spontaneous malignant glioma negatif dari mutasi pada gene ras K, H dan ekson 5-8 dari gene p53, serta  ekspresi protein p53 tidak terdeteksi melalui pewarnaan imunohistokimia seperti halnya perubahan genetik  pada malignant glioma manusia (Haseman et al., 1999).

Paparan inhalasi 1,3-butadiene pada tikus Sprague-Dawley tidak menginduksi tumor otak (Owen et al., 1987). Namun terjadi perkembangan malignant glioma dan neuroblastoma pada mencit B6C3F1 yang dipaparkan 1,3-butadiene dan hasil ini memberi kesempatan untuk membandingkan perubahan genetik yang terjadi antara tumor otak mencit dan manusia (NTP, 1984, 1993). Paparan mencit dengan 1,3-butadiene juga meningkatkan insidensi tumor pada sistem organ secara multiple dan mutasi pada tumor suppressor gene dan oncogene yang sering terdeteksi (Hong et al., 2000; Walker and Meng, 2000; Zhuang et al., 2000; Sills et al., 2001; Zhuang et al., 2002).

           

Berdasarkan studi tumor otak (malignat glioma) pada mencit B6C3F1 yang diekspos 1,3-butadiene, kandidat gene yang umumnya mengalami perubahan pada otak manusia  (p53, Ink4a/Arf, PTEN) akan dianalisa. Sebagai tambahan perubahan genetik ras K dan H juga akan diamati. Berdasarkan hasil studi ini diharapkan dapat menunjukkan adanya kesempatan ke depan untuk lebih memahami proses neurokarsinogenesis termasuk mempelajari peranan potensial bahan kimia dilingkungan sebagai agen menyebab perkembangan tumor otak yang terjadi pada manusia.

METODE PENELITIAN (berdasarkan penelitian Kim et al., 2015 )

Gambar 1. Skema ringkasan metode penelitian

Induksi Tumor Otak

Induksi tumor otak dilakukan pada mencit B6C3F1 jantan yang  berumur 6-8 minggu dengan cara dipaparkan dengan 200, 312, 625, atau 1250 ppm 1,3-butadiene secara inhalasi selama 6 jam per hari, 5 hari per minggu selama 13, 26, 40 atau 60 minggu dan dibiarkan lebih kurang selama 2 tahun (NTP, 1984; 1993).

Prosedur Rutin Histologi

Otak muncul tumor akibat paparan 1,3-butadiene dan dibiarkan selama 2 tahun kemudian dibuat preparat histologi sesuai prosedural rutin histologi. Otak difiksasi dalam neutral buffered formalin 10% kemudian diblok dalam paraffin. Jaringan diiris secara serial dengan ketebalan 5 μm untuk analisis histologi dan imunohistokimia (IHC) dan 10μm untuk isolasi DNA guna kepentingan PCR.

Pewarnaan Jaringan (HE dan IHC)

Irisan jaringan dengan ketebalan 5μm diwarnai dengan Hematoxylin dan Eosin (HE) untuk melihat histopatologi jaringan secara umum. Selain itu juga dilakukan pewarnan imunohistokimia untuk melihat ekspresi gen atau keberadaan protein tertentu (p53).

Pada pewarnaan imunohistokimia (IHC), setelah slide yang telah ditempeli jaringan (irisan) diinkubasi dengan H₂O₂  2% dalam methanol, kemudian dibilas dalam PBS 3 kali. Untuk antigen retrieval, digunakan 10 mM citrate buffer (pH 6.0) dalam pressure cooker selama 4 menit, kemudian didinginkan dalam PBS selama 20 menit. Irisan diinkubasi dengan normal goat serum (1/20 dalam PBS) selama 30 menit untuk menurunkan ikatan yang tidak spesifik kemudian di inkubasi dengan antibodi primer (NCL-p53-CM5p, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, UK, pengenceran 1/500) selama 60 menit pada suhu ruang. Selanjutnya diinkubasi dengan antibodi sekunder Vectastain Elite Vector Rabbit kit (Ig-6101, Vector Lab Inc, Burlingam, CA, USA). Kromogen yang digunakan adalah diaminobenzidin tetrahydrochloride (0.05g dalam Tris buffer H₂O₂). Irisan di counterstaining dengan Gill’s hematoxylin selama 30 detik dan dibilas dengan  PBS 3 kali, didehidrasi dalam ethanol bertingkat dan xylol, serta di mounting dengan larutan Eukitt.

Sequencing

Sebelum dilakukannya sequencing, dilakukan tahapan isolasi dan DNA serta PCR untuk amplifikasi gene. Metode isolasi DNA, PCR dan Sequencing (serta primer) berdasarkan Hong et al. (2000). Singkatnya DNA diisolasi dari irisan blok parafin yang mengandung neoplasma otak menggunakan DNAeasy tissue kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA). DNA diamplifikasi dengan polymerase chain reaction (PCR), menggunakan nested primer untuk ras K dan H. Touch-down PCR dihasilkan dari ekson 5 sampai 8 gene p53. Kontrol normal untuk ras K dan H atau gene p53 dan tanpa kontrol DNA di-running pada pengaturan reaksi yang sama. Hasil produk PCR dipurifikasi dengan QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valenicia, CA) kemudian digunakan untuk sequencing.

           

Pada sequencing digunakan sequencing kit (U.S. Biochemical, Cleveland, OH) serta α-³³P-dideoxynucleotide (ddNTP) terminators (A,C,G,T). Dalam proses sequencing, gene diamplifikasi dengan primer sequencing dan dilakukan 2 amplifikasi reaksi dari DNA asli untuk mengidentifikasi mutasi.

Analisis kehilangan heterozygositi (Loss of Heterozygosity / LOH) tumor otak mencit

Analisis alleotype berdasarkan Klein et al. (2000). Tumor otak diiris dari irisan blok parafin menggunakan razor blade tanpa mengambil bagian otak yang normal. Glioma dan neuroblastoma didigesti dalam tail buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris/HCl pH 9.0, 0.45% Nonidet P-40, 0.45% Tween 20) dengan 0.1 mg/ml Proteinase K (Roche, Indianapolis, IN) selama 5 jam pada suhu  55°C pada 400 rpm. Proteinase K diinaktivasi dengan pemanasan pada sampel selama 15 menit pada  suhu 85°C. Dua μl DNA digunakan untuk analisis LOH dengan cara di PCR. Reaksi sesuai standar yaitu denaturation 2 menit pada suhu 94°C diikuti 30 siklus (40 detik pada suhu  pada suhu 94°C, 50 detik pada suhu 55°C, 30 detik suhu 72°C), and 10 menit 72°C untuk siklus thermal akhir (GeneAmp PCR 9700, Applied Biosystem, Foster City, CA). Produk PCR di loading dalam gel agarose 2% untuk memisahkan allele C57BL/6 dan C3H. Kontrol postif berasal dari genomik DNA mencit yang memiliki C57BL/6-C3H, sedangkan kontrol negatif menggunakan air pada reaksi PCR dielektroforesis. Markers yang digunakan untuk analisis LOH yaitu D11Mit320 (ca 0.3 cM from p53), D19Mit19 (ca 1.7 cM from PTEN), and D4Mit27 (ca 7.7 cM from Ink4a/Arf) [http://www-genome.wi.mit.edu]; [http://www.informatics.jax.org].

HASIL

Terdapat enam maglinant glioma mecit B6C3F1 yang dipaparkan 1,3-butadiene (tabel 1) yang dideteksi dengan cara dinekropsi. Semua malignant glioma berada di anterior atau lobus olfaktori serebrum (gambar 2a).

Hasil HE dan IHC. Secara mikroskopik, glioma mengalami dermacated, dilapisis massa seluler dan infiltrasi neutrofil di lobus olfactori. Sel tumor menginvasi parenkima serebrum (gambar 2b). Malignant glioma mengandung pleomorphic dan sedikit sel glial  yang terdiferensiasi dengan nukleus yang besar (gambar 2c) yang dikarakteristikkan dengan adanya gambaran mitotik. Terdapat jelas area yang nekrosis dan pembuluh darah dengan sel endothel yang berproliferasi ) Secara imunohistokimia, 3 dari 5 maglinant glioma menunjukkan akumulasi protein p53 pada nukleus (gambar 2d) (Kim et al., 2005).

Gambar 2.Gambaran malignant glioma hasil paparan 1,3-butadiene pada mencit B6C3F1 (Kim et al.,2005)

1. Otak: mencit B6C3F1 jantan dengan 625 ppm 1,3-butadiene selama 26 minggu dan dibiarkan  selama 2 tahun. Malignat glioma: jaringan neoplastik berwarna putih (panah) pada lobus olfaktori serebrum. Bar = 0.45 cm.
2. Otak: mencit B6C3F1 jantan dengan 625 ppm 1,3-butadiene selama 26 minggu dan dibiarkan  selama 2 tahun. Malignat glioma: jaringan neoplastik berwarna putih (panah) pada lobus olfaktori serebrum. Sel neoplastik mengambil alih dan infiltrasi pada parenlim otak. H&E. Bar = 250 μm.
3. Otak: mencit B6C3F1 jantan dengan 625 ppm 1,3-butadiene selama 26 minggu dan dibiarkan  selama 2 tahun. Malignat glioma: sel neoplastik tersusun difus / menyebar, pleomorphik, sedikit diferensiasi, dan mengandung inti yang besar (panah panjang). terdapata gambaran mitotik (panah pendek). H&E. Bar = 70μm.
4. Otak: mencit B6C3F1 jantan dengan 625 ppm 1,3-butadiene sealama 26 minggu dan dibiarkan  selama 2 tahun. Malignat glioma: adanya akumulasi protein p53 (coklat) pada inti dari sel neoplastik. Metode kompleks Avidin-biotin peroxidase ntuk deteksi protein p53 dengan counterstain hematoxylin. Bar = 70 μm.

                                                                                       

Hasil Sequencing. Enam malignant glioma dari mencit B6C3F1 yang diekpos 1,3-butadiene dianalisa genetiknya dan terdapat  perubahan pada gene p53 dan ras H tetapi tidak terjadi mutasi pada ras K (table 2). Mutasi missense pada ekson 5-8 terdeteksi pada 3 dari 6 malignant glioma yaitu mutasi p53 diindetifikasi pada kodon 170, 192, 263 dimana terjadi transisi G menjadi A.

           

Hasil Analisa LOH. Kehilangan heterozigositas (LOH) dianalisis pada gen p53, Ink4a/Arf, dan pten. Teramati pada 4 dari 5 malignant glioma, semua tumor memperlihatkan hilangnya C3H(H) allele  dengan pengecualian 1 tumor dengan kehilangan parsial C57(B) allele pada gene p53 (gambar 6). LOH juga teramati di C57(B) allele pada gen Ink4a/Arf pada semua maglinant glioma. Namun tidak jumpai adanya LOH pada lokus di dekat gen pten.

Gambar 3. Analisis Loss of Heterozygosity (LOH) terhadap gene p53 pada tumor otak dari mencit B6C3F1 yang diekspos dengan 1,3-butadiene. Analisis digunakan primer PCR terhadap mikrosatelit marker D11Mit320 near p53. Sampel 3# (malignant glioma) menunjukkan hilangnya wild-type allele C3H. Sampel 4# (malignat glioma) terlihat kehilangan secara parsial wild-type pada allele C57BL/6. (Kim et al.,2005).

Daftar pustaka

Haseman, J. K., Elwell, M. R., and Hailey, J. R. (1999). Neoplasm incidences in B6C3F1 mice: NTP historical data. In Pathology of the Mouse (R. R. Maronpot, ed.), pp. 679–90. Cache River Press, Vienna, IL.

Hong, H. H., Devereux, T. R., Melnick, R. L., Moomaw, C. R., Boorman, G. A., and Sills, R. C., 2000. Mutations of ras protooncogenes and p53 tumor suppressor gene in cardiac hemangiosarcomas from B6C3F1 mice exposed to 1,3-butadiene for 2 years. Toxicol Pathol 28, 529–34.

Kim, Y., Hong, HH., Lachat, Y., Clayton, N.P., Devereux, T.R., Melnick, R.L., Hegi, M.E, dan Sills, R.C., 2005. Genetic alterations in brain tumors following 1,3-butadiene exposure in B6C3F1 mice. Toxicol Pathol., 33(3):307-12.

Melnick, R. L., and Huff, J. (1992). 1,3-Butadiene: toxicity and carcinogenicity in laboratory animals and in humans. Rev Environ Contam Toxicol 124, 111–44.

National Toxicology Program (1984). Toxicology and Carcinogenesis Studies of 1,3-Butadiene (CAS No. 106-99-0) in B6C3F1 Mice (Inhalation Studies). NTP TR 288, NIH Publication No. 84-2544. NIEHS, Research Triangle Park, NC.

National Toxicology Program (1993). Toxicology and Carcinogenesis Studies of 1,3-Butadiene (CAS No. 106-99-0) in B6C3F1 Mice (Inhalation Studies). NTP TR 434, NIH Publication No. 93-3165. NIEHS, Research Triangle Park, NC.

Owen, P. E., Glaister, J. R., Gaunt, I. F., and Pullinger, D. H. (1987). Inhalation toxicity studies with 1,3-butadiene, 3. Two year toxicity/carcinogenicity study in rats. Am Ind Hyg Assoc J 48, 407–13.

Sills, R. C., Hong, H. L., Boorman, G. A., Devereux, T. R., and Melnick, R. L. (2001). Point mutations of K-ras and H-ras genes in forestomach neoplasms from control B6C3F1 mice and following exposure to 1,3- butadiene, isoprene or chloroprene for up to 2-years. Chem Biol Interact 135–136, 373–86.

Walker, V. E., and Meng, Q. (2000). Part III: In vivo mutation of the endogenous hrpt genes of mice and rats by 1,3-butadiens and its metabolites. In: 1,3- Butadiene: Cancer, Mutations, and Adducts. Research Report 92. Health Effects Institute, Cambridge, MA.

Zhuang, S. M., Wiseman, R. W., and Soderkvist, P. (2000). Mutation analysis of the pRb pathway in 2_,3_-dideoxycytidine- and 1,3-butadiene-induced mouse lymphomas. Cancer Lett 152, 129–34.

Zhuang, S. M.,Wiseman, R.W., and Soderkvist, P. (2002). Frequent mutations of the Trp53, Hras1 and beta-catenin (Catnb) genes in 1,3-butadiene-induced mammary adenocarcinomas in B6C3F1 mice. Oncogene 21, 5643– 8.